实训一  高速冷冻离心机的应用（质粒DNA的小量制备）

在pH12.0～12.6的碱性条件下，线性的大Mr细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍保持自然状态。将pH调至中性并保持高盐浓度的条件下，染色体DNA之间形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，而共价闭环质粒DNA仍保持可溶状态，经离心可将大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质除去，质粒DNA仍留在上清液中，用酚、氯仿混合液抽提，可进一步纯化质粒DNA。

【预习思考】

1 离心操作的关键是什么？

2 离心原则是平衡和对称，如何才能做到？

3 质粒DNA是如何于总DNA区分的？

4为何第4步要强烈震荡，而第5，6步却要温和摇动？

 5 为何储存时加的TE中要含无DNase的 RNase酶A？

【实训目标】

1 学习质粒DNA的小量制备过程。

2熟练掌握高速冷冻离心机的操作步骤。

【实训用品】

1 仪器 台式高速冷冻离心机、台式小型旋涡震荡器、冰浴、离心管、电子天平（感量0.1mg和0.01g各一台）

2 试剂 Nacl、 Tris、EDTA、NaHO、SDS、乙酸钾、冰乙酸、饱和酚、氯仿、RNase、LB液

【实训方案】

（一）实训形式

试液配制、仪器使用、实训记录等，以4人为学习组，每4人一台仪器。

（二）药品配置

  LB培养基：氯化钠10 g，酵母粉10 g，蛋白胨5 g，pH7.0，定容至1L（需高压灭菌）。

 SET：0.1mol/L氯化钠；10m mol/L Tris –HCL（PH8.0）；1 m mol/L EDTA（PH8.0）.

 溶液I（需高压灭菌）：50 m mol/L葡萄糖，25 m mol/L Tris –HCL（PH8.0），10 m mol/L EDTA。

 溶液II（新鲜配置）：0.2 mol/L氢氧化钠，1%SDS。

 溶液III：每配置100 mL需取5 mol/L的 乙酸钾母液60 mL，再加冰乙酸11.5 mL，加水28.5 mL，混合好后为溶液III。其中含3 mol/L 钾离子和5 mol/L乙酸根离子，PH4.8。

 酚：氯仿（1:1）

 TE（需高压灭菌）:10m mol/L Tris，1m mol/L EDTA（配500mL需1 mol/L Tris 母液5mL，0.5 mol/L EDTA 母液1mL）。

 95%与70%的乙醇。

（二）实训前准备

样品处理：挑取一个大肠杆菌单菌落，接种于预先培养好的2～5毫升含相应抗生素的LB培养液中，或取50uL 冰冻保存的菌种接于50mL 相应的LB培养液中，置37OC摇床上（脓杆菌为28OC），强烈震荡培养过夜。

【实训现象、数据处理与结果、小结与评议】

（一）现象

 最后在离心管低部可看到白色沉淀，此为提取的DNA。

（二）数据处理与结果

 将沉淀TE溶解后每一管作为一个样品电泳，根据电泳结果评价DNA提取的质量和浓度。

（三）小结与评议

本实训核心问题是不同的离心速度的目的；各次离心后有时取上清有时取沉淀；摇动要在不同步骤采用不同程度摇动方式；质粒DNA 与总DNA区分原理。

考核与评价

一、操作技能考核

（一）题目

高速冷冻离心机的应用（质粒DNA的小量制备）。

（二）考核要点

1. 离心管在离心前的平衡与对称。

2. 离心机转头的选择与安装。

3. 离心离心机开机及转速的选择操作。

4. 按照操作规程正确操作实验每一步。

5. 质粒DNA 与总DNA区分原理。

6. 不同的离心速度的目的。

7. 各次离心后有时取上清有时取沉淀的原因。

8. 不同程度摇动方式的原因。

9. 文明操作。

（三）仪器

台式高速冷冻离心机、台式小型旋涡震荡器、冰浴、离心管、移液器、电子天平（感量0.1mg和0.01g各一台）

    （四）试剂

Nacl、 Tris、EDTA、NaHO、SDS、乙酸钾、冰乙酸、饱和酚、氯仿、RNase、LB液

（五）分析步骤

1. 挑取一个大肠杆菌单菌落，接种于预先培养好的2～5毫升含相应抗生素的LB培养液中，或取50μL 冰冻保存的菌种接于50mL 相应的LB培养液中，置37OC摇床上（脓杆菌为28℃），强烈震荡培养过夜。

2. 取1.5mL 培养液放入Eppendorf 管中，4℃，5000转离心5分钟，弃上清；

3. 加入1～1.5 mL SET缓冲液漂洗菌体，5000转离心5分钟，弃上清，收集菌体；

4. 将收集的菌体控干后，加100 μL 溶液I（冰浴中预冷的），在旋涡器上强烈震荡，使菌体悬浮；

5. 加200 μL 溶液II，盖紧管口，快速颠倒但不要震荡Eppendorf 管数次，将内容物充分混合，置冰浴中3分钟；

6. 加150μL预冷的溶液III，盖紧管口，来回翻转小管并轻轻震荡，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并在冰浴中5分钟；

7. 于4℃，12000转离心5分钟，将上清液移入另一Eppendorf 管中；

8. 加等体积酚：氯仿（1：1）混匀，4℃，12000转离心5分钟，将上清液移入另一Eppendorf 管中；

9. 加2倍体积的预冷乙醇，摇匀，冷置20分钟，4℃，12000转离心5分钟，弃上清；

10. 加1 mL 70%的预冷乙醇漂洗沉淀，4℃，12000转离心3分钟，弃上清；

11. 倒置控干后，加50 μL TE（PH8.0，含无DNase的 RNase酶A，20ug/mL）溶解DNA，置于-20 ℃储存。

二、技能考核评分表

操作评分细则