实训一 DNA的琼脂糖凝胶水平电泳

琼脂糖凝胶电泳是指用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一种电泳方法。这种方法用于研究核酸等大分子物质效果很好。利用琼脂糖电泳分离和分析蛋白质和核酸的基本原理是电荷效应和分子筛效应。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间。当琼脂糖介质的浓度较低时，胶的筛孔较大，适合于分离大分子的核酸或蛋白质及其复合物;当琼脂糖介质的浓度较高时，胶的筛孔较小，适合于分离小分子的核酸或蛋白质及其复合物（例如，质量分数为0.3%～1.0%琼脂糖凝胶可以分离较大片段的DNA，质量分数为2.0%的琼脂糖凝胶则可以分离小到300bp的双链DNA分子）。琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅为0.5～1ug。

【预习思考】

何谓电泳？

电泳的琼脂糖为何要配制不同浓度？

凝胶上样缓冲液的作用是什么？

【实训目标】

1.了解电泳的种类特点及琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围。

2. 理解DNA的分子大小及构型与迁移速率的关系。

【实训用品】

1 仪器 水平板型电泳装置、 家用微波炉、 凝胶成相分析仪、 微量取样器20μL或40μL、5 一次性手套、电子天平（感量0.1mg和0.01g各一台）

2 试剂 琼脂糖、溴酚蓝、DNA标准分子量、EB(或Goldview)

【实训方案】

试液配制、仪器使用、实训记录等，以4人为学习组，每4人一套电泳装置。

【实训过程】

DNA样品的制备---琼脂糖凝胶液的制备---凝胶板的制备---加样---电泳---染色及观察。

【实训前准备】

DNA样品的制备（植物叶片总DNA或质粒DNA或PCR扩增后的产物均可）。

【药品配置】

（1）电泳液（TBE 5X）： Ph 8.3Tris-硼酸-EDTA缓冲液（89 mmol/L Tris，89 mmol/L硼酸，2.5 mmol/LEDTA:称取10.78克Tris，5.5克硼酸，0.93克EDTA钠盐溶于无离子水中，定容到1000mL。）使用时稀释到0.5X。

（2）琼脂糖

（3）上样缓冲液（溴酚蓝-甘油溶液，0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液）：先配置0.1%溴酚蓝水溶液，然后取一份0.1%溴酚蓝水溶液与等体积的甘油混合即成。

（4） 标准DNA分子量（直接购置）

（5） 0.5μg/L溴乙啶染色液：称取5mg溴乙啶，用无离子水溶解，定容到10mL，取1mL稀释到1000mL，最终浓度为0.5μg/L 。

【数据处理与结果、小结与评议】

（一）数据处理与结果

1 将凝胶放置于凝胶成象系统上进行观察与照相。

（溴乙啶是较强至突变剂配置和使用时要带一次性手套，勿将溶液滴于台面或地面上。对带有溴乙啶的废弃物应妥善处理。）

（二）小结与评议

考核与评价

一、操作技能考核

（一）题目

 DNA的琼脂糖凝胶水平电泳。

（二）考核要点

1.电泳仪的连接与稳压稳流操作。

2.电泳槽的洗涤与组装。

3.凝胶板制作

4.点样

5.设计相应表格，正确记录原始数据，正确处理数据。

6. 文明操作。

（三）仪器

水平板型电泳装置、 家用微波炉、 凝胶成相分析仪、 微量取样器20μL或40μL、5 一次性手套、电子天平（感量0.1mg和0.01g各一台）

（四）试剂

琼脂糖、溴酚蓝、DNA标准分子量、EB(或Goldview)

（五）分析步骤

    1 DNA样品的制备（植物叶片总DNA或质粒DNA或PCR扩增后的产物均可）。

2 琼脂糖凝胶液的制备：称取1克琼脂糖，置于100毫升锥形瓶中，加入100毫升0.5倍TBE溶液，置于微波炉内加热至刚刚煮沸，带手套取出摇匀，使琼脂糖全部融化于缓冲液中。稍微冷却待用。

    3 凝胶板的制备：水平板型凝胶通常在一块与电泳槽配套购置的制胶模上灌制，但需要在灌胶前用胶带纸封住两端。将融化的胶液冷却至约60OC时，灌注于胶模上后，立即将梳子插于胶模的一端，注意梳齿两侧不能带入气泡，且调整梳子高度，使梳齿与胶模底部保持约1～2毫米的距离，放置15～20分钟，待凝胶液冷却形成凝胶块时，可轻轻拔下梳子，此时可见到加样品用的孔格，可开始加样。切记撕去胶带，使凝胶与电极槽相通后再开始电泳。

    4 加样： 铺一片洁净平整的塑料纸或封口膜，先用移液枪各吸取样品DNA 8μL于其上，再于每滴DNA上加溴酚蓝-甘油染料2微升（样品溶液:染料溶液 = 4:1），最后将每滴DNA与染料混合物吸起并加注于凝胶孔中。（注意为避免DNA 之间的污染，不同样品必须换新的枪头。将DNA 标号，并与胶孔标号相对应以确定各孔所加的DNA。）

5 电泳：对于规格为130mm*55mm*5mm的凝胶，通电维持60V，10mA，约需3小时。观察染料距凝胶末端1cm时断电结束电泳。

6 染色及观察： 取出凝胶模，将凝胶推到0.5μg/L溴乙啶的溶液中浸泡约半小时后取出并以清水洗涤。

二、技能考核评分表

操作评分细则

实训二  聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质分子量

 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以丙烯酰胺为单体，N,Nˊ-甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在催化剂过硫酸铵（AP）和引发剂（TEMED）的作用下，聚合成含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联起来而形成三维网状结构。这种网状结构具有分子筛效应，分离分子通过网孔的能力取决于凝胶孔的大小和形状，也取决于被分离分子的形状及大小。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量的原理是：蛋白质在聚丙烯酰胺凝交中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。在蛋白质溶液里加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。当SDS单体浓度大于1 mol／L时，大多数蛋白质与SDS的结合比例为1︰1.4。由于SDS带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质—SDS的复合物是近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度都一样，约为1．8 nm，而长轴则随蛋白质的相对分子质量成正比变化。这样蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和分子形状的影响，而只是椭圆棒的长度即蛋白质相对分子质量的函数。在一定条件下，蛋白质的Mr与电泳迁移率间的关系可用下式表示：

    Mr=k（10^-bm）                                 （6-5）

    lgMr=lgk-bm = k₁-bm                             （6-6）

式中：k，kl—常数

      b—斜率

      m---相对迁移率，用每个蛋白质带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的，即

                m=蛋白质带迁移距离/溴酚蓝迁移距离                （6-7）

由于染色、脱色和保存过程中，凝胶的膨胀或收缩将影响迁移率的变化，因此必须测量染色前和脱色后的凝胶的长度并按下式换算，来消除误差。

m=（蛋白质带迁移距离/脱色后凝胶长度 ）（染色前的凝胶长度/溴酚蓝迁移距离） （6-8）                               

    根据上述方程，可以将一系列已知Mr的标准蛋白质进行SDS-凝胶电泳，然后用每个已知Mr的标准蛋白质的电泳相对迁移率作横坐标，以Mr的对数作纵坐标作图，即得蛋白质Mr的标准曲线（为一直线）。待测Mr的未知蛋白质分子在相同条件下（同一块胶）进行电泳，测出其电泳迁移率，即可在标准曲线中求出其近似Mr。现在也可以使用凝胶扫描仪及影像的文件处理系统，可很快地从屏幕中读得未知样品的Mr并打印出来。

测定蛋白质相对分子质量的方法很多，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）、渗透压法、超离心法、凝胺过滤法等。SDS-PAGE法与其他方法相比，所需仪器设备较简单，操作方便，重复性较好，且不需非常纯的样品，因而被广泛用于蛋白质相对分子质量测定及蛋白质纯度鉴定。这是蛋百质化学研究工作中一种常用的重要研究方法。  

【预习思考】

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳的种类？

2.简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节凝胶的孔径?

3.为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？

【实训目标】

1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量基本原理及方法。

SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用。

【实训用品】

1 仪器 电泳仪，垂直板电泳槽，玻璃板，微量进样器

 2 试剂 Acr、Bis、Tris、SDS、甘油、巰基乙醇、甘氨酸、HCL， 过硫酸铵、甲醇、乙酸、标准分子质量蛋白、样品蛋白

【实训方案】

试液配制、仪器使用、实训记录等，以4人为学习组，每4人一套电泳装置。

【药品配置】

（1） 标准蛋白样品的制备，目前厂商生产低相对分子质量（14400—97400）及高相对分子质量（67000—669000）标准蛋白质试剂盒，用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定未知蛋白质相对分子质量，按试剂盒的要求加样品溶解液处理。

（2） 未知蛋白样品的制备：将未知蛋白样品按0.5～1mg／mL溶液的比例加入样品溶解液，然后转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时喷出），在100℃沸水浴中保温3 min，取出冷却后加样。如果处理好的样品暂时不用，可放在-20℃冰箱：保存较长时间，使用前在100℃沸水中加热3 min，以除去亚稳聚合态物质。

（3） 30％丙烯酰胺凝胶贮备液：取30 g丙烯酰胺（Acr）和0．8 g双丙烯酰胺（Bis）溶于蒸馏水中，定容至100 mL，过滤后4 ℃下贮存备用。

（4） 10％过硫酸铵（AP）溶液：称取过硫酸铵5 g溶解于蒸馏水中，定容至50 mL现配现用。

（5） 分离胶缓冲液（1.5 mol／L Tris—HCl缓冲液，pH 8.8）：称取18.15 g Tris溶解后，加6 mol／L HCl溶液4 mL，调pH至8.8，定容至100 mL。

（6） 浓缩胶缓冲液（0.5 mol／LTris-HCl缓冲液，pH 6.8）：称取6gTris溶解后，加6mol/LHCl溶液8 mL，调pH至6.8，定容至100 mL。

（7） 10％SDS溶液：取5 gSDS加蒸馏水溶解并定容至50 mL。

（8） 样品缓冲液（0.1％SDS-1％巯基乙醇-40％蔗糖或20％甘油-0.02％溴酚蓝-0.2％SDS）：取0.05 gSDS、0.5 mLβ-巯基乙醇、20 g蔗糖或10 mL甘油、0.1 mL 0.5％溴酚蓝、1 mLl0％SDS溶液，用水溶解定容至50 mL。

（9） 电极缓冲液（0.1％SDS-0.05 mol／LTris-0.384 mol／L甘氨酸缓冲液，pH 8.3）：取 Tris、甘氨酸（氨基乙酸）和SDS加水溶解后，调pH至8.3，定容至1 000 mL。

（10） 染色液（0.1％考马斯亮蓝-45％甲醇溶液-10％冰乙酸溶液）：取0.1 g考马斯亮蓝R-250，加入45mL甲醇溶液、10mL冰乙酸，用蒸馏水定容至100mL。

（11） 脱色液（7.5％冰乙酸-5％甲醇溶液）：取25 mL冰乙酸、50 mL甲醇溶液，加蒸馏水定容至1 000mL。

（12） 指示剂（0.5％溴酚蓝溶液）：取0.5 g溴酚蓝溶解于2 mL无水乙醇中，用蒸馏水定容至100 mL。

【实训过程】 

 安装夹心式垂直板电泳槽---配胶---凝胶板的制备---加样---电泳---染色、脱色

【数据处理与结果、小结与评议】

（一）数据处理与结果

1 以直尺或坐标纸精确测量溴酚蓝的迁移率和染色前凝胶的长度，以及脱色后各蛋白质样品带的迁移距离和脱色后凝胶的长度，计算出各蛋白质的相对迁移率。  

2 以各标准蛋白质样品的相对迁移率为横坐标，其相对分子质量的对数为纵坐标，在半对数坐标纸上作图，绘制出一条标准曲线。

3 根据待测蛋白质样品的相对迁移率的数值，可以直接从标准曲线上查得蛋白质样品相对分子质量（Mr）。

（二）小结与评议

考核与评价

一、操作技能考核

（一）题目

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白质分子量。

（二）考核要点

1.垂直电泳仪的连接与稳压稳流操作。

2.垂直电泳槽的洗涤与组装。

3.分离胶、浓缩胶的灌制。

4.点样。

5.设计相应表格，正确记录原始数据，正确处理数据。

6. 文明操作。

（三）仪器

电泳仪、垂直板电泳槽、玻璃板、微量进样器

（四）试剂

 Acr、Bis、Tris、SDS、甘油、巰基乙醇、甘氨酸、HCL， 过硫酸铵、甲醇、乙酸、标准分子质量蛋白、样品蛋白

（五）分析步骤

1 安装夹心式垂直板电泳槽

夹心式垂直板电泳糟操作简单，不易渗漏。这种电泳糟两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极中间夹有一个凝胶模，该模由1个凹形硅胶框，长、短玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。电泳槽由上贮槽（白金电极在上或面对短玻璃板）、下贮槽（白金电极在下或面对长玻璃板）和回纹状冷凝管组成。两个电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定。各部分依下列顺序组装：

（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，放在桌面上。

（2）将长、短玻璃分别插到硅胶框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃，以保持玻璃洁净。

（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。

（4）将下贮槽的钉孔对准已装好螺丝钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。竖置电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶框交界的缝隙内加入已熔化的琼脂液，其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。    

2 配胶  

根据所测定蛋白质相对分子质量范围，选择适宜的分离胶浓度，本实验宜选用10％的分离凝胶3%的浓缩凝胶进行电泳分离，凝胺的配制参照表6-2：

3 凝胶板的制备  

（1）分离胶的灌注与聚合：将已配好的分离胶沿玻璃板缓缓注入已准备好的凝胶模中，注胶过程中应防止气泡产生，胶加到距玻璃板顶部3cm处，立即覆盖3～5mm的水层，静置聚合，约30～60min 。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。  

（2）浓缩胶的灌住及制备：分离胶聚合好后，除去水层，并用滤纸条吸干。另配制好的浓缩胶迅速倒在分离胶上层，并插队样品糟模板梳子，静置聚合约40min，聚合好后，加上电极缓冲液，小心取出样品槽模板，整理好样品槽备用。  

4 加样

用微量加样器按号向凝胶样品槽加标准蛋白样品和未知蛋白样品，加样的体积根据凝胶酌厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为10～30uL，如样品较稀可多达100uL。

5 电泳

加样完毕，上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，开始可用20～40mA电流，过浓缩胶后可用60～80mA电流进行电泳，当指示染料溴酚蓝迁移至距凝胶下端约lcm处，即可停止电泳，整个电泳过程约4h。    

6 染色，脱色

电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器吸满蒸馏水。将针头插人凝胶与玻璃板之间，沿玻璃板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注入，最后注入少量空气，取出针头，将两玻璃板轻轻揭开后即可取出凝胶板；将凝胶浸没于染色液中1h左右，倾出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次后加人脱色液，数小时换液一次；约换脱色液5～6次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止。

二、技能考核评分表

操作评分细则