实验教案
实训一 标准PCR扩增潮酶素基因
PCR法以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与一条单链模板DNA上的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异性DNA 片段。一般反应过程是：①反应系统加热至94℃，底物双链DNA 变性为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；②降温至35～60℃，使两种引物分别与模板DNA 链的3ˊ一端的互补序列杂交（复性）；③升温至72℃耐热性DNA聚合酶催化引物按5ˊ→3ˊ的方向延伸，合成模板DNA 链的互补链。重复以上过程，经过3次循环，就可出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链 ，所以每循环一次，底物DNA 的拷贝数增加一倍。因此PCR经过n次循环后，待扩增的特异性DNA片段基本上达到2n个拷贝数。一般经过30次循环后实际扩增倍数可达到1×105-3×106。
【预习思考】
1 PCR反应是如何重复进行DNA复制过程？
2 PCR反应过程为什么要谨防污染？如何防止污染？
3 PCR的拓展技术有哪些？
4引物与退火温度设计一般应遵循的规律？
【实训目标】
1 PCR技术影响因素
2 PCR操作注意事项
3 在PCR仪上标准PCR的设定内容
【实训用品】
1 仪器 PCR仪、PCR管（0.2mL，需高压灭菌）、 微量移掖枪（0.5～10μL和10～100 μL）及配套枪头（需高压灭菌）、 一次性手套 、 冰浴、小型台式离心机、 超净工作台
2 试剂 超纯水、10XPCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、4XdNTP混合物、5ˊ端与3ˊ端特异引物：潮酶素基因的特异引物序列
HPT R 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT- 3'
HPT F 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT- 3'
【实训形式】
试液配制、仪器使用、实训记录等，以4人为学习组，每4人一台仪器。
【实训过程】
制备PCR反应体系---设计反应温度、时间与循环次数---开机扩增---PCR产物鉴定。
【实训现象、数据处理与结果、小结与评议】
（一）现象
PCR结束后，PCR管内看不到变化，也看不到结果。
（二）数据处理与结果
需要把PCR管完成后取下，每一管作为一个样品进行电泳，根据电泳的结果评价PCR结果的好坏。
（三）小结与评议
考核与评价
一、操作技能考核
（一）题目
标准PCR扩增潮酶素基因。
（二）考核要点
1.PCR仪的开机、关机。
2.完整PCR程序设置与调用。
3.PCR五要素
4.PCR三部曲
5.PCR样品配置与分装。
6.PCR管的离心与安放。
7.文明操作。
（三）仪器
PCR仪、PCR管（0.2mL，需高压灭菌）、 微量移掖枪（0.5～10μL和10～100 μL）及配套枪头（需高压灭菌）、 一次性手套 、 冰浴、小型台式离心机、 超净工作台
（四）试剂
超纯水、10XPCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、4XdNTP混合物、5ˊ端与3ˊ端特异引物：潮酶素基因的特异引物序列
HPT R 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGCAGGT- 3'
HPT F 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT- 3'
（五）分析步骤
1 DNA样品的制备：提取含潮酶素基因的质粒DNA（见试验“质粒DNA 的少量制备”）。
2 PCR的反应体系
在一个无菌的0.2mLEppendorf 离心管内加入下列试剂，使总体系为25 μL：
反应物 体积 终浓度
① H2o 11.5μL
② 10X缓冲液 2.5 μL 1×缓冲液
③ 4XdNTP混合物（各10mmol/L） 0.5 μL 各200 μmol/L
④ 引物（各8pmol/μL ） 2.5μL 各20 pmol/每个反应
⑤ 模板DNA 5μL 20ng 靶序列/每个反应
⑥ Taq DNA聚合酶 0.5μL 0.5-1单位/每个反应
实际操作时，首先整个操作要在4 ℃以下或冰上进行；另外可先在一PCR管中加入除模板DNA和Taq DNA聚合酶以外的各种试剂的10个PCR的总量（上表中各种试剂体积的10倍），后加入10倍体积的Taq DNA聚合酶，然后将其混匀，再分状成10个PCR管，然后各管加入各自对应的DNA样品，同样将其混匀。编号并离心后可进PCR仪中扩增。
3 设计反应温度、时间与循环次数：
在PCR仪上设计94℃4分钟，然后进入循环，循环中第一步为94℃ 变性1分钟，第二步为58 ℃退火45秒，第三步为72 ℃延伸1分钟40秒，共进行30次循环，后再72 ℃延伸10分钟以提高产物的扩增率，便可结束扩增，取出放在4℃条件下终止反应。
4 PCR产物鉴定：
反应结束后，取10μLPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，用0.5μg/L溴乙啶（EB）染色，在凝胶成像分析仪上进行分析。
二、技能考核评分表
操作评分细则
