实训一     果实菠萝蛋白酶的活力测定

一  目的

1  了解酶活力单位的定义。

    2  掌握果实菠萝蛋白酶的活力测定的实验操作。

    二  实验原理

   酶的活力也称为酶活性，是指催化一定化学反应的能力。酶的活力单位，1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件下，一分钟内能转化1微克分子底物的酶量，或是转化1微克当量底物的有关基团的酶量。温度选定为25℃，其它条件如pH及底物浓度均采用最适条件。这是一个统一的标准。但使用起来不方便，因此对具体酶活力的测定主要仍按习惯用法，即用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示（单位／克或单位／毫升）。在本实验中，果实菠萝蛋白酶活力单位定义为：一个酶活力单位在pH7.2，35℃时水解酪蛋白产生的溶于三氯乙酸的小肽在275nm的光密度值等于1ug/ml酪氨酸在275nm的光密度值（0.01）。

三  仪器和试剂

1  仪器：uv-120紫外分光光度计；冷冻离心机；试管（15ml）；烧杯；容量瓶（100ml）；移液管；漏斗；恒温水浴；分析天平。

2  试剂：Na₂HPO₄；NaH₂PO₄；三氯乙酸；乙酸钠；酪蛋白；L-半胱氨酸；EDTA；冰乙酸。

3  溶液的配制

（1）25mM磷酸缓冲液（Ph7.2），100ml

称取Na₂HPO₄0.895g；NaH₂PO₄2.39g，用蒸馏水溶解并定容到100ml。

（2）酶反应终止液（D）

称取9克三氯乙酸，15g乙酸钠，19.5ml冰乙酸，加入蒸馏水溶解并定容至500ml。

四  实验步骤

1．反应体系的准备

酶液的准备（A₁）：称取菠萝3克，加入25mM，PH7.2的磷酸缓冲液进行研磨，最后定容为25ml，4000r/min离心15分钟，上清即为菠萝蛋白酶液。

酪蛋白液（B）：称取酪蛋白，加入25mM，PH7.2的磷酸缓冲液进行溶解，配成浓度为1%的酪蛋白溶液。

L-半胱氨酸--EDTA液（C）：称取L-半胱氨酸和EDTA，用25mM，PH7.2的磷酸缓冲液溶解并定容，使L-半胱氨酸和EDTA的终浓度为5mM和1mM。

    3．酶活性的测定

将A₁，B，C，D四种溶液分别在35℃恒温水浴中保温。取4只15ml的试管，菠萝蛋白酶及其的对照各2只，按下表进行操作：

酶反应体系中，加入A1，B，C后混匀，在35℃下保温10分种，然后加入5mlD液终止反应，35℃下，静置30分钟，过滤。实验的对照组，条件与反应组完全相同，只是在加入底物（B液）之前，先加入D液，使酶失活。滤液在uv- 120紫外分光光度计上，275nm测定光密度值。