实训一  逆转录PCR（RT-PCR）

　　RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）的简称，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被反转录成为互补DNA(cDNA)，再以此cDNA为模板合成另一互补链,双链cDNA通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)的过程称为“反转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来完成。随后，cDNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，成为双链cDNA。以后, 双链cDNA随每个循环倍增，即通常的PCR。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA分子。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量,从而了解相关基因的表达。

RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR), 为了与反转录PCR相区别，通常将实时PCR写作RTQ-PCR(real-time quantitative PCR), 或称之为“定量PCR” (quantitative PCR)。

一、实验目的

掌握逆转录PCR的原理和实际操作步骤。

二、实验原理

逆转录PCR是一种间接扩增的RNA并进行检测的方法。原理是先将RNA逆转录为cDNA链后，进行常规PCR扩增，通过对扩增产物的检定，来推测mRNA的量。RT-PCR技术可将RNA检测灵敏度提高几个数量级，使极微量的RNA样品分析成为可能。在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，对RNA要求较为严格，作为模板的RNA，分子必须完整，且不含DNA、蛋白质和其它杂质。因为，RNA如混有DNA，会出现非特异性扩增；如蛋白质未除净，将影响逆转录和PCR。一般采用酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取理想的RNA。常用的逆转录酶有2种，即禽类成髓细胞性白血病毒的逆转录酶（AMV），和莫洛尼鼠类白血病毒的逆转录酶（MMLV）。该法的不足之处是因其灵敏度较高，应注意非特异性扩增，排除假阳性的结果。

三、实验材料

    多聚A mRNA或总RNA。

四、仪器设备及用具

    （1）恒温水浴       （2）PCR仪         （3）电泳仪及电泳槽

    （4）紫外灯检测仪   （5）Eppendorf管   （6）自动微量移液器

五、试剂

    1. RNA模板(RNA或总RNA)

    2. cDNA引物(25 mg／L)

    3. 10×反转录缓冲溶液(500 mmol／L，pH 8.3 Tris-HCl，400 mmol／L KCl，50 mmol／L MgCl₂，10 mmol／L DTT，l g／L BSA)    

    4. 10 mmol／L 4种dNTP

    5．AMV反转录酶

    6．RNA酶抑制剂

    7. Taq DNA聚合酶    

    8. 10×PCR缓冲溶液(100 mmol／L，pH 8.4 Tris-C1，400 mmol／L KCl，20 mmol／L MgCl₂，10 mmol／L DTT，1 g／L BSA)

    9．扩增引物(150 mg／L于水中)

六、实验步骤

    1. RNA的逆转录

   （1）在一个无菌的0.5 mL Eppendorf管中，加入5 μg RNA模板和25 μg (3 pmol) cDNA引物, 再加入适量无菌重蒸水，使其总体积为10 μL。将Eppendorf管置于70℃水浴，保温5分钟，迅速冷却至室温以破坏mRNA二级结构。

   （2）cDNA的合成

    在室温下再依次加入下列溶液：2 μL 10×AMV反转录缓冲液、2 μL 4种dNTP混合液(各10 mmol／L)、20 U RNA酶抑制剂和15 U AMV逆转录酶，加无菌重蒸水至总体积为20 μL。轻轻混匀，将Eppendorf管于42℃保温l小时。反应结束后，用95℃加热5分钟，使反转录酶失活。

    2. PCR扩增cDNA

    在灭菌的0.5 mL Eppendorf管中，依次加入20 μL上述逆转录产物、10 μL 10×PCR缓冲溶液、5 μL扩增引物、2 μL dNTP混合液(各10 mmol／L，pH 7.0)和2.5 U Taq DNA聚合酶，

最后加无菌重蒸水至总体积为100 μL，混匀。PCR条件为：变性温度为94℃，时间为45秒至1分钟；退火温度为50～60℃，时间为1～1.5分钟；延伸温度为72℃，时间为1～1.5分钟，共进行35个循环，最后一次循环延伸时间至10分钟。反应结束，将反应管置于-20℃保存。

    3. PCR产物的鉴定

    可取10 μL PCR产物(视产物量之多少适量增减)，用1％琼脂糖凝胶或5％聚丙烯酰胺凝胶电泳，1 mg／L溴乙啶(EB)染色，紫外灯下观察产物条带。根据PCR产物的电泳迁移率与DNA的Marker标准物的迁移率相比较，计算出产物的相对大小。进一步的鉴定，则需用核酸探针进行分子杂交和测定产物的核苷酸序列。

    注意事项:

   （1）cDNA合成时，可以选择下游区的PCR引物、随机六聚体引物或寡聚 (dT 12-18)，应用dT的质量为0.1 μg，应用六聚体的量为100 pmol。

   （2）设计引物时最好是分散在不同的外显子上，以免基因组DNA的污染。如果引物位于分子的外显子上，遇RNA和基因组DNA产物的大小不一样，容易分开。

   （3）常见问题处理

    1) 第一条cDNA链产物产量低或没得到

    A．RNA被降解  通过变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性。确保试剂、加样器尖头及反应管均无RNA酶。在有核酸酶抑制剂存在的情况下分离RNA。

    B．AMV反转录酶高温灭活  如果在实验的开始加人了一个变性／火步骤，则应确保在变性步骤及以后的42C恒温之后再加入含有AMV反转录酶的混合物。

    C．引物的特异性  核对“下游”引物是否与RNA下游序列相互补。

    D．引物退火  如果以寡聚(dT)作为“下游”引物，则应确认在反转录反应之前，用适当的温度进行退火反应。

    E．RNA纯化问题  一些RNA纯化过程中遗留的试剂(如SDS、NaCl、肝素、异硫氰酸胍)会干扰RT-PCR，影响目的RNA的质量。

    2) 扩增产物的分子量高于预期值

    可能是与模板RNA相关的基因组DNA污染了RNA制备物，使用无RNA酶的DNA酶可消化污染的DNA，而模板RNA不受影响。    

    3) 扩增产物产量低或没有扩增产物

    A．循环数不够  将反应体系再进行5个循环。    

    B．热循环仪程序出现错误  检查设置的时间和温度是否正确。    

    C．热循环仪中的一些部位温度太低  设定一组阳性对照，用以确认在热循环仪的某些特定部位PCR产物的产量是否太低。

    D．反应条件不合适  降低退火温度和(或)针对较长的扩增产物而延长延伸时间。

    E．遗漏反应体系中的组分  查对反应体系中的组分并重新进行反应。

    F．矿物油的问题  反应体系必须用高质量的、无核酸酶活性的轻质矿物油覆盖。不要使用经高压灭菌处理过矿物油。

    G．反应管未经高压灭菌处理  将反应管进行高压灭菌，去除抑制扩增的污染物。

    H．引物设计不当  确认引物无自身互补或引物间不互补，检查PCR引物长度及Tm。

    I．扩增产物产量低或没有扩增产物或产生多个非特异性扩增产物

  a, 引物的特异性错误：检查所设计的引物是否与正确的链互补；

  b, 反应条件不是最佳：优化Mg²⁺浓度、退火温度及延伸时间。确认两条引物浓度相同；

  c, 核苷酸降解：将核苷酸小量分装冻存, 快速融化后置于冰上, 避免反复冻融；

d, 目的序列不在目的RNA上：重新设计实验，或尝试用其他来源的目的RNA；

e, 检查PCR引物的长度和Tm。避免在引物的3’端使用3个连续的G或C；

f, 目的RNA中含有多个目的序列：设计新引物；

g, 体系被另一目的RNA／DNA污染：加样时减少交叉污染；在扩增前和扩增后分别应用独立的操作区域和加样器；戴手套并经常更换；采用灭菌方法来防止DNA遗留到后续反应中。       

七、思考题

1. 论述反转录PCR与反向PCR和实时PCR的区别。

2. 试论应用RT-PCR研究外源基因转录表达的优缺点。