一、目的
1、了解分离纯化蛋白质，并进行蛋白质定量的原理及方法
2、了解利用醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量操作方法。
二、原理
血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0，在pH8.6巴比妥缓冲液中，它们均电离成阴离子，在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同，所以在电场中的泳动速度不同。一般所来，蛋白质分子量小而带电荷多者，泳动速度快，分子量大而带电荷少者泳动速度慢，因此可以利用其泳速不同将之分开。
血清中含有清蛋白、α－球蛋白、β－球蛋白、γ－球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同，在电场中的迁移速度不同（见下表）。

本实验用醋酸纤维素薄膜作为支持物进行电泳，分离各种血清蛋白。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳，染色后可显示5条区带，从阳极到阴极依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。
醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成，具有均一的泡沫结构，厚度仅120mm。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点：①电泳后区带界限清晰；②通电时间较短（二十分钟至一小时）；③它对各种蛋白质（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都几乎完全不吸附，因此拖尾现象；④对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一，不影响样品的分离效果，由于醋酸纤维素素薄膜水量较低，因此必需在密闭的容器中进行电泳，并使用较低有电流避免蒸发。
    由于醋酸纤维素素薄膜作为支持物进行蛋白电泳，具有以上优点。故本实验最终采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。
三、材料
（一）器材
醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿，点样器，电泳仪，电泳槽，粗滤纸，镊子
（二）材料
新鲜血清（未溶血）
（三）试剂
1、巴比妥缓冲液（pH 8.6，离子强度0.06）：巴比妥1.66g, 巴比妥钠12.76g，加水至1000ml。置4℃冰箱保存，备用。
2、染色液：氨基黑10B 0.5g, 甲醇50ml, 冰醋酸10ml，蒸馏水40ml，混匀。
3、漂洗液：含95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。
4、透明液：冰醋酸25ml，无水乙醇75ml，混匀。
四、方法
（一）准备电泳槽
电泳槽内放入巴比妥缓冲液。电泳槽应密闭使蒸汽饱和，避免水分蒸发。将电泳槽与电泳仪接好。
（二）点样
1、浸泡：用镊子取醋酸纤维素薄膜『注1』1张（识别光泽面和无光泽面），无光泽面朝下小心平放在盛有缓冲液的培养皿中，浸泡30min左右（浸至无白斑）。
2．点样『注2』：将浸透的薄膜从缓冲液取出（无光泽面朝上），用滤纸吸干多余的液体。点样时，先在点样器上均匀地沾上血清，在距阴极端1.5cm处将点样器轻轻地印在薄膜上，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线后迅速离开（见图）。

醋酸纤维素素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）

三）电泳：
电泳槽架上分别用4层纱布连接电泳槽。将点样后的薄膜条置于纱布上，点样面朝下，点样端置于负极侧，薄膜条应平直，并与纱布紧贴。盖好电泳槽盖，静止平衡5min后通电，调节电压10-15V/cm，电流0.5mA/cm，电泳30-60min。

（四）染色与漂洗：

1、电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡1-2min。

2、漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上，晾干。


图4.7血清蛋白醋酸纤维素素薄膜电泳图谱示意图
 
（五）定量
1、洗脱比色：将各蛋白质区带仔细剪下，分置各试管中，另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0．4mol／lNaOH4ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡)，待颜色脱净即用波长620nm比色，以空白管调零读m各管吸光度。
2、计算：
吸光度总和(T)=A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清蛋白组分的相对百分数：
A % =  A/T×100%
α1 % = α1/T×100%
α2 % = α2/T×100%
β % = β%/T×100%
γ % = γ%/T×100%
注意事项
『注1』  市售醋酸纤维素素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。
『注2』  点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。