双向电泳的第一向IEF 电泳采用IPGphor，实验将变得很简单。IPGphor 包括半导体温控系统(18°C-25°C)和程序化电源(8000V，1.5mA)。可采用普通型胶条槽一步 完成胶条的水化、上样和电泳，大大减少操作步骤。IPGphor 一次可进行12 个胶条槽的电泳(7, 11, 13 ，18 ，24cm)，因采用高电压(8000V)，可缩短聚焦时间。最新推出 的通用型杯上样胶条槽因采用可移动的上样杯和电极，适合任何长度的IPG 胶条，尤其适合极性等电点蛋白的分离。

IPG 胶条的水化和电泳

仪器：

IPGphor

试剂：

水化液（8M 尿素，2%CHAPS，15mM DTT 和0 .5%IPG 缓冲液）：

水化液需当天新鲜配制(可配成储液分装-20 度保存，但不可反复冻融)。

尿素溶液加热温度不能超过37°C， 否则蛋白会发生氨甲酰化。

 实验步骤：

一. 加样品水化

1. 用样品溶解缓冲液(9M 尿素， 4%CHAPS ， 2%IPG 缓冲液，40mM DTT,40mM Tris-base)溶解样品 。蛋白质上样浓度不要超过10mg/ml，否则会造成蛋白质的集聚或沉淀。

2.吸取适量(见下表)含有样品的水化液放入标准型胶条槽中，为确保样品充分进入胶条中，不要加入过量的水化液。

IPG 胶条所需水化液体积

（*如果水化时加入样品， 此体积是加入样品后的终体积）

3.从酸性端（尖端）一侧剥去IPG 胶条的保护膜，胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下IPG 胶条平端(阴极)，使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条的两端与槽的两端的电极接触。

4.IPG 胶条上覆盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油，盖上盖子。

5.将标准型胶条槽的尖端背面电极与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端背面电极与 IPGphor 仪器的阴极平台接触。

6.设置IPGphor 仪器运行参数：IPG 胶条水化的电压，温度和时间；等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见下表。

IPGphor 运行条件

低电压时水化， 有利于高分子量蛋白进入胶中，并减少蛋白形成聚集体。

7.IPG 胶条水化后可自动进行等电聚焦电泳。

8.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80 °C 保存几个月。

注意：不推荐每条IPG 胶条的电流超过50µA，因为这有可能产生过多的热量且有可能损坏胶条和槽，IPG 胶条甚至会烧胶。

二、不加样品水化

(一) 标准型胶条槽：

1.用适量的水化液进行胶条水化，方法同步骤3-5，水化过夜。

2.于胶条糟的加样孔中加入浓缩的样品。每个加样孔的一侧可加入7.5ml样品(每个加样孔分别有两侧可加样)，采用此种方法上样，每个胶条槽最多可加入30ml 样品。

3.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度，电泳参数见表 。

4.进行等电聚焦电泳。

5.暂时不进行第二向的IPG 胶条可夹在两层塑料薄膜中于-80°C 保存几个月。

(二)通用型杯上样胶条槽：

1.采用Immobiline DryStrip 水化盘或标准型胶条槽进行IPG 胶条的水化，加入适量的 水化液进行胶条水化，方法同步骤3-4，水化过夜。

2.将通用型杯上样胶条槽的尖端与IPGphor 仪器的阳极平台接触；胶条槽的平端与IPGphor 仪器的阴极平台接触。

3.将已水化的IPG 胶条转移到通用型杯上样胶条槽。胶面朝上，先将IPG胶条尖端(阳性端)朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，胶条必需横跨胶条槽的与IPGphor 仪器的两个电极板接触的区域。对于7cm 和11cmIPG胶条，需将IPG 胶条的平端距离胶条槽平端大约1.5cm 处放置，并确保胶条位于胶条槽的中央(通用型杯上样胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置的位置)。

4.在IPG 胶条表面上盖适量 Immobiline DryStrip 覆盖油(3-5ml)，充满整个胶条槽 。

5.取两个IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。

6.分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，分别将电极压在两个电极片的外缘。

7.样品杯可放在两个电极间除胶条槽内侧凸起外任何位置，对于碱性分离范围的IPG 胶条，尽量将样品杯靠近阳极放置。

8.在样品杯中加入少量不含样品的水化液检查是否漏液。上样前吸走水化液。

9.上样前将样品离心去掉不溶物，每个样品杯最多可加样100μl。

10.盖上胶条槽的盖子，再盖IPGphor 仪器的盖子。

11.设置IPGphor 仪器运行参数：等电聚焦电泳时的梯度电压和温度。电泳参数见表。

IPG 胶条的平衡：

  IPG 胶条平衡两次，每次15 分钟。平衡缓冲液包括6 M 尿素和30% 甘油，会减少电内渗，有利于蛋白从第一向到第二向的转移。第一步平衡在平衡液中加入DTT，使变性的非烷基化的蛋白处于还原状态；第二步平衡步骤中加入碘乙酰胺，使蛋白质巯烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化，碘乙酰胺并且能使残留的DTT 烷基化(银染过程中，DTT 会导致点拖尾"point streaking") 。将IPG 胶条轻轻润洗，并去除多余的平衡缓冲液，然后放入第二向SDS 胶中。

  如果缩短平衡时间，会影响一部分蛋白从IPG 胶条转移到SDS 胶的效率。这种情况下建议在蛋白从 IPG 胶条转移到SDS 胶后，将IPG 胶条染色，以检查是否所有蛋白都已离开IPG 胶条。

仪器：

玻璃管 (200 mm 长, 20 mm i . d .), Parafilm, 振荡仪

试剂：

1. 4x 分离胶缓冲液（1.5M Tris- HCl, pH8 .8 和0.4%（w/v）SDS ）：

45.5 g Tris 和1 g SDS 溶于200 ml 去离子水中，用6N HC l 调节pH 到8.8 ，最后用去 离子水将体积补足到250ml，加入25mg 叠氮钠并过滤。此溶液可于4°C 储存两周。

2. 平衡缓冲液 (0.05 M Tris -HCl , pH 8.8 ，6 M 尿素, 30% (w/v) 甘油和2% (w/v) SDS )：180 g 尿素, 150 g 甘油, 10 g SDS 和16.7 ml 分离胶缓冲液溶于去离子水中，最终将 体积补足到500ml。此种缓冲液可于室温下保存两周。

3. 溴酚蓝溶液: 0.25% (w/v) 溴酚蓝溶于分离胶缓冲液中25 mg 溴酚蓝溶于10 ml 分离胶缓冲液中， 4°C 储存。

实验步骤：

1. 使用前每10ml 平衡缓冲液中加入100mg DTT (相当于平衡缓冲液I)，根据下表 加入适量平衡缓冲液I 和溴酚蓝溶液。取出IPG 胶条分别放入玻璃管中( 支持膜贴着管壁， 每个玻璃管中放入一条IPG 胶条) ， 用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡15 分钟，倒掉平衡缓冲液 I。

2. 每10ml 平衡缓冲液加入400mg 碘乙酰胺 (相当于平衡缓冲液II)。根据下表加入适量平衡缓冲液II 和溴酚蓝溶液。用Parafilm 封口，在振荡仪上振荡15 分钟，倒掉平衡缓冲液 II。

IPG 胶条平衡液用量

3.用去离子水润洗IPG 胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分 钟，以去除多余的平衡缓冲液。

4. IPG 胶条的转移： 将IPG 胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条支持膜贴着其中的一块玻璃板，用一薄尺将IPG 胶条轻轻地向下推，使整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在IPG 胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。

5. 可选操作：加入分子量标准蛋白

  分子量标准蛋白溶液与等体积的1%琼脂糖溶液混合后，加入到IEF上样纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5%的琼脂糖会凝聚，在施加电压前可以防止标准蛋白的扩散。

其他可选的方法是，将标准蛋白以15-20 µl 的体积加入到IEF 上样滤纸片。如要减少加样量将上样滤纸片切成更小的面积。将上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上，然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG 胶条末端一侧，与板胶的凝胶表面接触。

6. 最后用琼脂糖密封液进行封顶，用少量的密封液（ 约1-1.5ml) 使IPG胶条被完全覆盖住，在此过程中不要产生气泡。