聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
一、目的
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理
1． 电泳
带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2． 影响电泳的主要因素
若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：
F引＝E·q （1）
式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻 相对抗。故上述现象不会发生。根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：
F阻 ＝6πrηv (2)
式中F阻 是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此，
E·q＝6πrηv (3)
将（3）式整理得：
V= | E·q | (4) |
6πrη |
由此可以看出，粒子移动的速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（r）和溶液的粘度（η）成反比。非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
既然在一定pH条件下，每一分子都具有特殊的电荷（种类与数量）、大小和形状，在一定的时间内它在相同的电场中便应集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。
由于带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。为了便于比较，常用迁移率（或称泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率（泳动度）的定义为“带电粒子在单位电场强度下的泳动速度”，若以m表示迁移率，则
m= | v | (5) |
E |
将（4）式代入（5）式，得
m= | E·q |
| q | (6) |
6πrη | = | |||
E | 6πrη |
由（6）式可以看出，迁移率（泳动度）仅与球形粒子所带电荷的数量，粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度a随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率u为迁移率m和当时条件下电离度a的乘积。即：
u=m·a (7)
将（6）式代入（7）式，得：
u= | q·a | (8) |
6πrη |
由（8）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对有效迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。在支持介质中进行的各种电泳，除以上因素影响外，有效迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。
最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：
Ⅰ＝ | 1 | ΣmiZi2 | (9) |
2 |
（9)式中，mi为离子的克分子浓度，Zi为离子的价数。
3． 聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。
光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。
聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T％表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表1）。
表1 凝 胶 浓 度 选 用 表
物 质 | 分 子 量 范 围 | 适用的凝胶浓度(%) |
蛋 白 质 | ＜104 | 20～30 |
1×104～4×104 | 15～20 | |
4×104～1×105 | 10～15 | |
1×105～5×105 | 5～10 | |
＞5×105 | 2～5 | |
核 酸 | ＜104 | 15～20 |
104～105 | 5～10 | |
105～2×106 | 2～2.6 |
4． 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
系统的不连续性表现在以下几个方面：
（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：
（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：
① 由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
② 在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：
V＝ | I |
S |
所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。
当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。
三、实验材料、仪器和试剂
1． 实验材料
小麦幼苗
2．仪器
（1）垂直板电泳槽及附件（玻璃板、硅胶条、梳子、导线等）
（2）稳压稳流直流电泳仪
（3）高速离心机（10 000r/min）
（4）量筒：500mL×1，10mL×1，5mL×1
（5）烧杯：250mL×4
（6）微量注射器（50μL）
（7）其他：玻棒、大培养皿等
2． 试剂
贮液配制方法见表2。
表2 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法
序号 | 试 剂 名 称 | 配 制 方 法 |
1 | 1.5％琼脂 | 1.5g琼脂，100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。 |
2 | 分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) | 取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 |
3 | 浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) | 取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 |
4 | 分离胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅱ) | Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。 |
5 | 浓缩胶丙胶贮液 (Acr-Bis贮液Ⅰ) | Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶物，装入棕色试剂瓶，4℃保存。 |
6 | 10％过硫酸铵溶液（Ap） | 10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。 |
7 | 四甲基乙二胺（TEMED） | 原液。 |
8 | 核黄素溶液 | 核黄素4.0mg，无离子水溶解后定容至100mL。 |
9 | 电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) | Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释10倍。 |
10 | 40％蔗糖溶液 | 蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。 |
11 | pH4.7乙酸缓冲液 | 乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定容至1 000 mL。 |
12 | 7％乙酸溶液 | 19.4 mL 36％乙酸稀释至100 mL。 |
13 | 样品提取液，pH8.0 (pH8.0 Tris-HCl缓冲液) | Tris 12.1 g，加无离子水1 000 mL，以HCl调节pH至8.0 |
14 | 0.5％溴酚蓝溶液 | 0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。 |
15 | 联大茴香胺染色液 | 联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95％乙醇中，加20 mL蒸馏水，使用前加3％H2O2 4～5 mL（当天配制） |
四、操作步骤
1．贮液配制
按上表配制贮液，但应注意
（1）配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放1～2个月。
（2）过硫酸铵应当天配制。
（3）如有不溶物要过滤。
（4）显色液用前再混和。
（5）电极缓冲液用时稀释10倍。
2．电泳槽的安装
垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。
将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5％琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。
3． 凝胶的制备
将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。
（1）按表3比例配制分离胶
将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2～3mm的水层（或水饱和正丁醇），静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。
（2）按表4比例配制浓缩胶
注：TEMED在灌胶前加。
先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子（即样品槽模板），待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。
4．样品的制备
称取小麦幼苗茎部0.5 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8 000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40％蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。
5．点样
用微量注射器（50μL）吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽15～50μL。点样时须小心，防止样品液的扩散。
6．电泳
将电泳槽放入冰箱，接好电源线（前槽为负极）。打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。
7．剥胶
取出电泳胶板，去掉胶套，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻棒协助将分离胶放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的大培养皿中浸泡10min。
8．染色、记录结果
倒去乙酸缓冲液，加联大茴香胺染色液，使淹没整个胶板，于室温下显色20min，即得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。该酶活性染色过程如下：过氧化物酶分解H2O2产生氧基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。
倒掉染色液，重新加入7％的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。
五、附注
1．如果室温较高，可适当减少电流，延长电泳时间，或采取降温措施，以免温度过高造成酶活损失。
2．工业纯丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）的纯化方法
（1）Acr的纯化
称取70g的Acr，于50℃溶于1 000L三氯甲烷（A.R.）中，趁热过滤，冷至－20℃，使结晶，于冷处用布氏漏斗抽滤，用冷的三氯甲烷短时间冲洗，继续抽滤，收集结晶，在真空干燥器中彻底干燥。将白色纯结晶保存于棕色瓶中，熔点为84.5±0.3℃。
（2）Bis的纯化
称取12g的Bis溶于40～50℃的1 000L丙酮（A.R.）中，趁热过滤，慢慢冷至－20℃，于冷处过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。白色结晶保存于棕色瓶中。
六、思考题
1． 电泳要求的基本条件有哪些？
2． 丙烯酰胺凝胶电泳的制胶过程中，哪些因素影响胶的凝聚？
3．电泳系统的不连续性表现在哪几个方面？存在哪几种物理效应？
4．简述酶活性染色的过程？
参考答案
1．电泳的基本条件为：（1）电泳应尽可能在恒温条件下进行。（2）选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。（3）有效迁移率还受电渗现象的影响，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。（4）选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02～0.2之间。
2．TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。以光敏感物核黄素（VB2）作为催化剂进行光聚合时，应避免过量氧的存在。
3．系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板的上、下两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（3）在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
4．该酶活性染色过程如下：过氧化物酶分解H2O2产生氧基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。