实验题目：蔗糖酶分子量的检测——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
教  师：XXX

实验类型：基础
学　　时：8(参考)

内　　容：

一、实验目的   
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。

掌握垂直板电泳的操作方法。

运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。

二、实验原理   
聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量（有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏特小时）

凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单，样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏离。

三、试剂与器材 
低分子量标准蛋白试剂盒、30%丙烯酰胺（Acr）、10%过硫酸铵、10%SDS（十二烷基磺酸钠）、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液、0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液 、TEMED（四甲基乙二胺）、样品溶解液、固定液、染色液、脱色液、电极缓冲液

垂直板电泳装、置直流稳压电源、移液管、滤纸、微量注射器、大培养皿

四、操作方法

1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的锥形瓶.
2.把玻璃板在灌胶支架上固定好.
3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置40分钟.
注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟.
5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖.
6、加样三个:
（1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。
（2）取10µl样品1溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量分别为5µl和10µl。
7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在沸水中加热3分钟，去掉亚稳态聚合。
8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。
10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
绘制标准曲线

以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。

五、关键步骤与注意事项

1、固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.

2、凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.

3、水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡
4、凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面.
5、样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

6、要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.

7、注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散. 
8、为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

9、剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。

六、思考题

1、在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?

2、电极缓冲液中甘氨酸的作用?

3、在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?

4、样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟