提要
1.应用开发指南
2.引物设计软件
3.实验设计思路
4.技术应用举例

应用开发指南

应用开发基本流程

•探针设计指南
–免费赠送Primer Express软件
–TaqMan探针Tm68ºC -70ºC
–MGB探针Tm65ºC -67ºC
•引物设计指南
–引物Tm58ºC -60ºC
–短PCR产物50-150bp
•PCR程序指南
–通用的PCR条件  2步法：95ºC @15sec, 60ºC @ 1 min
•实验条件快速优化指南
–所有实验在同样条件下完成
–固定的PCR试剂浓度2X TaqMan®Universal PCR Master Mix
–只需简单优化引物/探针浓度

引物设计指南
1.先设计探针，再设计引物；
2.引物要尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠；
3.G-C含量保持在30-80%之间；
4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；
5.用Primer Express^®软件计算出来的Tm值应当在58-60 ℃之间；
6.在引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个。

为什么要避免3’端的G和C？
Design rule:5 nucleotides at the 3' end have only 1-2 G+C’s

Transient binding at 3' end of probeis quickly stabilised by the DNA polymerase

MGB探针设计指南
1.探针的5' 端第一个碱基不能是G；
2.用Primer Express®软件计算出来的MGB探针Tm值在65 -67°C 之间；
3.探针要尽可能地短，但是不要短于13个碱基；
4.避免同一碱基重复过多，特别是不可有连续4个或更多的G；
5.C比G多的探针效果更好，如果C少于G，则使用互补链；
6.检测SNP或者基因突变，多态或突变位点尽量位于探针中央，可以±3个碱基并在倒数第二个碱基之前。

探针设计指南
基因表达、cDNA定量研究，特别设计探针跨过两个外显子，增强反应特异性


为什么探针要C比G多？

MGB探针设计指南
SNP和基因突变位点在MGB探针中的位置


Primer Express软件

探针的荧光标记

热循环程序指南

引物浓度优化指南

引物浓度优化

探针浓度优化

Lowest Ct and highest delta Rn is better

定量PCR基本流程

1.准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA)
2.PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix)
3.填样品表(样品名、孔位，样品类型、探针颜色)
4.设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线)
5.运行PCR，自动分析数据
6.进一步分析数据(基线、阈值、C_T值、相对表达等)

DNA反应体系


反应体积：96孔板25 -50 uL；384孔板5 -20 uL

cDNA反应体系

反应总体积：96孔板25 -50 uL；384孔板5 -20 uL

实验设计思路

实验设计策略

中医中药现代化
•实验方案设计
–选择具有免疫调节功能的中药单方或配伍（1方）
–选择免疫相关基因（5个）
–选择对该中药反应敏感的实验对象（50人）
服药前（对照）、服药后不同时间点（共5点）
–RNA /cDNA制备：选择外周血或者特异的免疫组织（2种）
–反应总数：5个基因x 50人x 5个时间点x 2种组织x 6次重复= 15000
•所需资源预算
–7000型定量PCR仪（1台）
–96孔板160块，按每天4块计算，1个半月完成(40天)
–试剂：网上定购5种基因表达试剂盒(20 x，250 uL/kit)
(10uL/rxn, 500 rxn/kit x 6 kit= 3000 rxn/gene)
TaqManUniversal PCR Master Mix试剂盒
(2000反应/kit/25 uL，10uL 5000反应x 3 kit)
反转录试剂盒(共500rxn, 200 rxn/kit x 3 kit)

SNP与表现型
Classic Association Studies


肝硬化的个体差异
•假设前提：人胶原IV基因及其调控序列的多态性是肝硬化个体差异的原因之一。
•实验方案：
–SNP位点：在人胶原IV基因上挑选8个SNP位点
>调控序列，外显子，剪接点，Block
–样本组：50个病人+ 50个正常对照
–DNA提取：外周血
–反应总数：800个
•成本估算：
–时间：大约10块96孔板，3天完成
–试剂：定购8种SNP试剂盒或代客合成服务
肝硬化个体差异结果分析
•正常组50人：AA 38，AG 10，GG 2
•疾病组50人：AA 20，AG 10，GG20
•3X2 卡方统计分析，计算P值
–小于0.05：显著差异
–小于0.01：非常显著
•讨论：
–该位点GG纯合子基因型可能与肝硬化的发生有关系
–如果是随机选择的SNP位点，则致病基因可能位于该位点附近
–如果临床诊断或分类不准确，则结论站不住脚

免费软件SNPbrowser
SNP字典：全部4百万个人类SNP位点，4万个人类基因
中国人、日本人、白人、黑人4个人群的单倍型信息
免费下载：www.allsnps.com

与药效相关的SNP研究
个体化用药
药物作用的靶位点


技术应用举例

I类应用：实时定量

II类应用：终点读板
•基因突变分析
–单基因遗传病诊断，如血友病、地贫
•SNP扫描
–疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的鉴定
–SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效的个体差异
–药物副反应的预防，如麻醉意外
•物种鉴定、菌株鉴定
–各种病毒，细菌，病毒
–病原体检测，如炭疽菌，E coli. O157

荧光定量PCR的临床应用
•遗传疾病的早期诊断 肿瘤的诊断
•抗病毒药物疗效的观察、指导
•病情评估和预后判断
•新药验证 输血源的筛选
•母婴传播的控制与观察

定量病人血漿中的EBV病毒
1999，香港中文大學病理系，Dr. Dennis Lo
研究结论：
EBV是導致鼻咽癌的主因之一
實驗結果:
1.96%的病人可被偵測得到EBV之存在
2.鼻咽癌晚期的EBV DNA量比早期較高
3.放射線治療後,EBV DNA無法被偵測
4.ABI 7700定量PCR方法可應用於監測療程中之病毒量變化

偵測HCV之病毒量
--1999，Dr. Tomoko Takeuchi，Japan
--HCV是導致肝病變的原因之一
--實驗結果:
a. 98%的病人於慢性肝炎期可被偵測到HCV之存在
b. 95.8%的病人於肝壞疽期可被偵測到HCV之存在
c. 100%的病人於肝細胞腫瘤期可被偵測到HCV之存在
d. 利用干擾素治療前後來偵測HCV病毒之改變量

偵測病人痰中的肺結核桿菌量
--1998，Dr. L. E. desjardin，USA
--Mycobacterium tuberculosis是導致肺結核(TB)的主因之一, 而病人經抗結核桿菌治療後, 仍長期出現在痰中
--實驗結果:
a. 偵測TB IS 6110 target gene
b. 傳統瓊酯膠培養耗日廢時(6~8週)
c. 可用來定量早期肺結核的量

偵測病人活體組織與子宮頸抹片的HPV病毒量
--1999，Dr. Agnetha Josefsson，Sweden
--人類乳突狀病毒(HPV)是導致子宮頸癌的幫凶,臨床症狀顯示,有HPV感染者,未必罹患有子宮頸癌,但罹患有子宮頸癌之患者,90%有HPV感染
--實驗結果:
a. 針對HPV type 16,18,31,33,35,45進行篩檢