1.定量PCR的实验要

96孔板设置举例


样品

标准品

目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系
不要求：
数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA
可以使用相同的DNA
也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段……
要求：
5点以上
浓度已知
PCR效率一致，且接近100%
•仪器一致
•反应条件一致：循环参数、同一次实验
•试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液

梯度稀释方法
选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释
CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间
10倍连续梯度稀释方法：
1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v
切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v

标准品单位
标准品的性质决定最终结果的性质：
DNA标准品，已知拷贝数→绝对定量，得未知样品拷贝数
DNA标准品，已知ng/uL→绝对定量，得未知样品ng/uL
DNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数→相对定量，得未知样品之间相差倍数
RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA→相对定量，得未知样品ngRNA/uL
􀂋注意测定对单位的要求
如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段
如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）

PCR效率对定量结果的影响

测定PCR效率

•标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？
•当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？
做几条标准曲线？
Relative Standard Curve
Comparison of the c-mycexpression level in brain, kidney, liver and lung
Standard: Raji Cell line total RNA
Endogenous Control: GAPDH

管家基因—IPC
通常以uL或者ug为单位取样
细胞培养液：同样体积，细胞数目并不同样
DNA溶液：抽提效率和操作误差，同样体积的DNA并不来源于同样数目的细胞
copy/uL要校正成copy/cell才有意义

IPC的定义
••什么是什么是IPCIPCIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率
••IPCIPC的作用的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。
IPC的选择标准
-在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)的表达量都恒定不变
-注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的
-多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高
-推荐使用Human Endogenous Control Plate (P/N 4309920)测试不同管家基因的效果
-常用的内对照有18S rRNA、β-actin、GAPDH等
•在使用TaqMan MGB探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？
扩增效率要一致

曲线斜率< 0.1

校准荧光ROX

ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关

校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、

仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等
减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性和精度
ROX校准的效果

重复样品
重复次数请遵循统计学的要求
小样本统计，n>6
未知样品和标准品都要重复
所有复管在同样条件下完成PCR
•你为什么会想到做多重定量？
•多重定量能达到目的吗？

定量PCR的数据处理
绝对定量与相对定量

绝对定量与相对定量

•绝对定量

–优点：给出目标基因的绝对数量，数据容易处理
–缺点：必须有标准品，做标准曲线，难以制备和质控

•相对定量
–优点：可以不做标准品；标准品容易制备；
使用广泛
–缺点：数据理解困难

绝对定量：绝对标准曲线法
目标：测定目标基因的准确拷贝数

绝对定量误差的校正
•生物学方面的误差：IPC校正
细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等
•物理方面的误差：ROX校正
枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等
•其余的误差：统计校正
重复实验，取平均值
绝对定量的数据处理
•管家基因校准(Normalization Gene)

相对定量有两种方法
定义：比较同一基因在不同样品中的表达量
结果：数据是%，没有单位
方法：相对标准曲线法和ΔΔC_T法
应用：应用最广泛，功能最强大
相对定量：相对标准曲线法
标准品：可以只知道梯度稀释的稀释倍数
相对定量误差的校正
•生物学方面的误差：IPC校正
细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等
•物理方面的误差：ROX校正
枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等

•其余的误差：统计校正
重复实验，取平均值

相对定量的数据处理
•管家基因校准(Normalization Gene)
–得出每个细胞中的[目的基因]
–目标基因vs. 管家基因
•对照样品校准(Calibrator Sample)
–得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample.
–处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常….

相对标准曲线法计算示例

相对定量：ΔΔCT法
依据：平均相对含量% = 2 –平均ΔΔCT好处：不做标准曲线
ΔΔC_T=ΔC_TUnknown-ΔC_TCalibrator=

%与ΔΔC_T的关系

平均相对含量= 2 –^{平均ΔΔC_T}

%与ΔΔCT的关系

平均相对含量 = 2 ^{–平均ΔΔC_T}

ΔΔC_T法计算示例

注意：如果反应效率不高，则差别被高估。
–当ΔΔC_T= -1.2
>E=1，2.3 倍差别
>E=0.9，2.2倍差别
>E=0.5，1.6倍差别

•ΔΔCT法相对定量要求PCR效率一致且接近100%，标准曲线法相对定量没有这样的要求，对吗？
•相对定量要做管家基因吗？
•相对定量要做重复实验吗？
•加样量变化了，相对定量的结果会随着变化吗？

ΔC_T与相对定量

只要PCR效率相同，ΔC_T就保持恒定
相对定量研究举例

相对定量研究举例

自动分析：RQ软件

•绝对定量要做管家基因吗？
•绝对定量要做ROX校正吗？
•绝对定量要做重复实验吗？