实时定量PCR技术原理

提要
基本概念
定量PCR的数学原理
定量PCR的化学原理
等位基因鉴定原理
定量PCR仪光学原理

基本概念
什么是PCR？
•PCR能否只用一条引物？三条引物？
•PCR能否使用ddNTP？

典型的PCR四阶段

PCR理论方程
N = N₀×(1+e)ⁿ
N:产物分子数
N₀:起始分子数
e：扩增效率
n:循环次数

循环次数

起点定量与终点定量
起点量是样本中原来的DNA量，更有意义；
终点量经过PCR 放大，并非研究所期望的数据􀁺
起点定量误差小，终点定量误差大
标准曲线方法

通过CT值测定起始DNA量

定量PCR的数学原理
什么是C_T值荧光信号有统计学意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数
从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数
线性图谱

C_T值

半对数图谱

C_T值

•浓度增加1倍，CT值减小1个单位
•浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
为什么C_T ∝起始DNA浓度?

C_T值与起始DNA浓度的关系

•单拷贝检测在理论和实验上能做到吗？
•最理想的标准曲线斜率是多少？
什么是阈值
基线信号的标准偏差×10

基线→阈值→C_T值
基线调整规则
如果C_T值>18，不需调整，使用自动分析结果
如果C_T值<18，修改终点，再分析一次
起点：进口试剂取3，国产试剂取6
终点：最小的CT值–4，通常为15
长度：大于或等于6个循环

PCR方程只在指数期成立
CT值和阈值必须位于指数增长阶段内


手工数据分析方法
1.实验结束，软件根据默认值的基线(3-15)自动分析，给出结果和图谱
2.如果C_T值> 18，使用自动分析结果，出报告
3.如果有C_T值<18，根据[最小的C_T值-4]
修改基线终点，重新分析数据

软件自动的数据分析方法
软件自动计算全部参数：基线、阈值、CT值、浓度

•能否用鼠标拖阈值线以正确区分阴性与阳性？
•阈值与DNA浓度成反比，对吗？

定量PCR的化学原理
两种定量化学

•染料染色
–SYBR&reg;Green I
–溴乙锭(EthidiumBromide)
•探针标记

–TaqMan^TM
–TaqManMGB
–Dual-oligoFRET pairs
–分子信标(Molecular beacons)
–ScorpionsTM/AmplifluorTM

1、TaqMan探针



TaqMan探针定量原理



共振能量转移

荧光共振能量转移(FRET)

当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团.

这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。

2、TaqManMGB探针
MGB探针能够分辨1个碱基的差别

完全配对，有信号


一个碱基不配对，没有信号

TaqManMGB探针原理

MGB探针的优势

两种探针比较

Cycle Number
ΔT_m决定探针杂交特异性

C•ΔTm = T_m配对-T_m不配对

•要有效地区分等位基因，退火/延伸温度必须落在ΔT_m区间内
3、分子信标(Molecular beacon)TaqMan
探针的衍生形式


4、杂交双探针
TaqMan探针的衍生形式

探针法小结
既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合
双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合

•4种探针相比较，你更倾向于使用哪种？
SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一种DNA小沟结合染料

SYBR Green I荧光染料
在PCR过程中染料与DNA结合发光

染料法小结
成本低
不需要探针
适合初步筛查
先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品
熔解曲线
鉴定PCR有无杂带、引物二聚体
无模板特异性
不能分辨主带与杂带，给出的是总信号
不能做多重检测
每孔只能检测一个目标基因
灵敏度低
适合于5000 拷贝以上的基因定量

熔解曲线(Dissociation curve)
只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要
[原始数据]

[导数图谱]

•能否用融解曲线区分点突变或SNP？
•探针能做融解曲线吗？
多重荧光定量
•原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因不同的探针识别不同的靶基因不同的探针标记不同的颜色。
•特点一次提取DNA/RNA、一次反应得出多个定量结果信号之间要保证互不干扰

多色荧光技术
荧光定量需要ROX校正和IPC校正
检材和对照可以在同一管中定量
仪器须有多荧光检测能力

荧光染料功能分类
Reporter dye : 6-FAM、VIC、TET、NED
Quencher dye:
TAMRA (TaqMan 探针)
Dark Quencher (MGB 探针)
Reference dye: ROX
-passive internal referencefor signal normalisation
-allows relative (not absolute) fluorescence to be measured
-critical for precision

7000：4色荧光

7900：4色荧光

7300：4色荧光

7500：5色荧光
•5 片激发滤色片、5片发射滤色片

•增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件
•你为什么会想到做多重定量？
•多重定量能达到目的吗？
等位基因鉴定原理
两种探针加入同一管

等位基因鉴定实验分两步

等位基因鉴定实验数据


定量PCR仪光学原理
光学结构简图

AB定量PCR仪大家族

定量PCR仪功能一览
•绝对定量(Absolute Quantification)
–自动计算基线、阈值、CT值、浓度、百分比
•相对定量(Relative Quantification)
•等位基因分型(Allelic Discrimination)
•阴阳性鉴定(Plus/Minus with IPC)
定量PCR仪的性能


实时定量小结
污染机会少：闭管化学
没有后处理：不用杂交、电泳、拍照
操作简单：高度自动化
用途广泛：既能定量又能定性
灵活：既可多点测定，又可单点测定